Identificazione dell'enzima nicotinammide mononucleotide deamidasi, "orphan enzyme" della biosinstesi della vitamina B3

Nell’ultimo decennio le nostre conoscenze relative alla biosintesi e al riciclo della vitamina B3 negli eubatteri sono notevolmente aumentate sia grazie al sequenziamento del genoma di numerose specie batteriche che ha consentito lo sviluppo di analisi di genomica comparativa, sia grazie all’avanzamento degli studi sulla struttura e funzione di molti degli enzimi coinvolti. Tuttavia, alcuni enzimi chiave rimangono ancora appartenenti alla categoria dei cosiddetti “orphan enzymes”, enzimi la cui attività è stata sperimentalmente dimostrata, ma di cui non si conoscono ancora i geni corrispondenti. Fa parte di questa categoria l’enzima nicotinammide mononucleotide (NMN) deamidasi il quale catalizza la conversione dell’ NMN a nicotinato mononucleotide (NaMN) e quindi gioca un ruolo essenziale nella conversione della vitamina B3 nella sua forma coenzimatica NAD. L’esistenza di questo enzima è documentata in numerosi studi che hanno dimostrato direttamente la presenza di una significativa attività NMN deamidasica in estratti di cellule batteriche. Inoltre, nei batteri il cui genoma è stato sequenziato, l’esistenza dell’enzima può essere indirettamente predetta attraverso la ricostruzione in silico dell’insieme delle vie metaboliche responsabili della biosintesi e della conversione a NAD della vitamina. Infatti, la ricostruzione del pattern metabolico nelle specie batteriche in grado di convertire la vitamina B3 a NMN, ma che mancano dell’enzima che catalizza la conversione diretta dell’ NMN a NAD, evidenzia l’esistenza di un gap metabolico (missing gene) che può essere colmato solo ipotizzando l’esistenza di un’ attività NMN deamidasica in grado di indirizzare l’NMN alla via deamidata per la sintesi del NAD, che appare priva di gaps. Oltre a svolgere un ruolo chiave nella conversione della vitamina B3 a NAD, l’NMN deamidasi potrebbe essere importante per il controllo dei livelli intracellulari di NMN: è riportata infatti un’azione tossica dell’NMN nei confronti dei batteri a causa della suo effetto inibitorio sulla DNA ligasi NAD-dipendente. In aggiunta l’enzima potrebbe essere coinvolto anche nella biosintesi della vitamina B12 in quanto il prodotto della reazione catalizzata, l’NaMN, è il donatore del gruppo riboso-fosfato indispensabile per la sintesi della vitamina B12. Nonostante numerosi tentativi il gene codificante l’NMN deamidasi rimane sconosciuto. In questo lavoro viene descritta l’identificazione del gene per mezzo della purificazione e del sequenziamento dell’enzima NMN deamidasi dal batterio Shewanella oneidensis.In the last decade our understanding of the enzymology of vitamin B3 biosynthesis and recycling in eubacteria has greatly advanced thanks to the development of genomic sequencing and comparative analysis, as well structural studies. However, some key enzymes still remain in the category of “orphan enzymes”, i.e. enzymes described in literature, for which no corresponding genes have been so far reported. Among them is the enzyme nicotinamide mononucleotide (NMN) deamidase that converts NMN into nicotinate mononucleotide (NaMN) and plays a key role in the conversion of vitamin B3 to its coenzymatic form NAD. The existence of such an enzyme is demonstrated by the detection of a significant catalytic activity in bacterial cell extracts, as well as by the in silico metabolic reconstruction of the potential biosynthetic machinery of vitamin B3 and NAD in the sequenced bacterial genomes. This analysis in fact underscores the existence of a metabolic gap (missing gene) in the pathway of those species where the conversion of vitamin B3 into NMN occurs in the absence of an enzyme able to directly convert NMN to NAD. Such a gap would be filled by an enzymatic activity channeling NMN toward the deamidated NAD biosynthetic pathway. Besides playing a key role in the conversion of vitamin B3 to NAD, the enzyme NMN deamidase might be involved in the control of intracellular NMN levels: NMN is in fact believed to be toxic for bacteria, due to its inhibitory effect on NAD-dependent DNA ligase. In addition, the enzyme might be also involved in vitamin B12 biosynthesis; in fact the product of the catalyzed reaction, NaMN, is the donor of the phospho-ribose group, essential for vitamin B12 biosynthesis. Despite many attempts, a gene encoding NMN deamidase remains missing. Here, we describe the identification of the gene, following purification and partially sequencing of NMN deamidase from the bacterium Shewanella oneidensis